Egy madaraknál használt molekuláris ivarmeghatározó módszer leírása
Vili Nóra, alk. zoológus hallgató, IV. évfolyam
A különféle ökológiai, szaporodás- és viselkedésbiológiai vizsgálatoknál, illetve bizonyos konzervációbiológiai kezeléseknél nagyon fontos az egyes egyedek nemének ismerete. A madárfajok nagy részénél nem okoz gondot, hogy megfigyelés alapján, távcsővel azonosítsuk a két ivart. Más esetekben, amikor az ivari dimorfizmus nem olyan mértékű, hogy ránézésre el lehessen dönteni, hogy a látott madár tojó vagy hím (pl. ha csupán az egyiket látjuk, mert így a méretkülönbség sem segít), vagy esetleg fiókáról van szó, valamilyen más módon kell „bizonyosságot szerezni”.
Elpusztult egyedeknél kézenfekvő megoldás lehet a boncolás, élő madaraknál pedig a laparatómia. Utóbbi azonban elég nagy stresszel jár (befogás, illetve maga a beavatkozás), valamint kellő gyakorlat kell hozzá.
Az utóbbi időkben már a cytometriás és molekuláris módszerek is eléggé elterjedtek. Ilyen a karyotípus alapján, vagy hibridizációval történő ivarmeghatározás. Ezek fajra jellemzőek, nem általánosíthatóak. A madarak vörösvérsejtjei magvasak, ezért vérvétellel elegendő sejtet és DNS-t lehet nyerni a vizsgálathoz. Bizonyos esetekben azonban a vérvétel nem megoldható, hanem valamilyen más, nem-invazív mintavételi eljárást kell alkalmazni (pl. a kihullott tollakból kell DNS-t kivonni). Ilyenkor nagyon jó módszer a PCR-en alapuló technika.
A madaraknál a tojó a heterogametikus ivar (WZ ivari kromoszómák) és a hím a homogametikus (ZZ), tehát a W kromoszómát, vagy annak szekvenciáit kell keresni, elkülöníteni. Nemrégiben fedezték fel az első W-hez kötődő gént madarakban (Griffiths és Tiwari 1995), ami a kromo-helikáz DNS-kötő fehérje kódolásáért felel, és a legtöbb fajra jellemző. (Mivel nagyon hasonlít az emberi CHD gének közül a CHD1-hez, a CHD1W nevet kapta.)
A CHD1W-nek van egy nem a W kromoszómához kötődő változata (szintén a legtöbb fajnál), mégpedig a Z kromoszómán. Mivel egyrészt a CHD1 gének az ivari kromoszómák rekombinálódó pszeudoautoszomális régióin kívül helyeződnek a CHD1W csak tojókra jellemző, másrészt mindkét gén nagyon konzervatív, alkalmasak lehetnek az ivarok azonosítására.
A két CHD1 gén jelenléte miatt, ha csupán a W kromoszóma meglétén, vagy
nem meglétén alapulna a rendszer, akkor a negatív eredményeket nem lehetne
értékelni. Ilyen esetben az eredmény származhatna abból, hogy a vizsgált
egyed hím, de abból is, hogy valamilyen hiba miatt nem zajlott le a PCR-reakció.
Az pedig, hogy a két génmásolat közül csak az egyiket amplifikáljuk nagyon
körülményes lenne, mivel nagyon hasonlóak.
Megoldás lehet a termékek emésztése olyan restrikciós enzimekkel, amelyek
specifikusan csak az egyik kromoszómán jelenlevő génváltozatban hasítanak.
Azonban ennek a módszernek is megvannak a korlátai és nehézségei.
Az általunk használt módszert 1999-ben A. K. Fridolfsson és H.Ellegren
dolgozták ki. Ez különösen alkalmas az olyan fajok vizsgálatához, amelyeknél
nem-invazív mintavételre van szükség, a faj veszélyeztetettsége, vagy
más technikai nehézségek miatt. Ennek az az alapja, hogy olyan primereket
alkalmaznak, amelyek eltérő méretű intronokat határolnak a két kromoszóma
esetén. Ilyen a pl. 2550F/2718R pár (amit mi is használunk), amely mindkét
génváltozatot amplifikálja. A termékek között kb. 150 bázispár különbség
van.
A primerek nem csak egy fajra, hanem különböző rendekből származó madaraknál
is alkalmazhatók. A módszer beállításakor 50 fajt néztek, 11 rendből és
ezek közül 47-nél megbízhatóan működött ez a primerpár. Egy barázdabillegető-
és két cinkefajnál nem lehetett különbséget tenni, mivel a génszakaszok
mérete közel azonos volt. Más primerekkel (3007F/3112R és2987F/3112R)
azonban megoldódott a probléma, és az énekesmadarakra is alkalmazhatóvá
vált a módszer. (A futómadarak kivételével - nagy valószínűséggel - minden
fajra működik, az ő esetükben az itt használt primerek egyike sem adott
nemre jellemző mintázatú terméket.)
A mintavétel: A mintát nem-invazív módon vesszük, parlagi sasok begyűjtött tollaiból vonjuk ki a DNS-t.
Először proteináz-K-val emésztjük a tolldarabot (illetve a kipreparált felső köldököt), majd LiCl-os, kloroform/izoamilalkoholos kisózással történik a DNS kivonása. A kivont DNS-t TE-pufferben beoldva fagyasztóban tároljuk.
A PCR-reakció: 15µl térfogatban zajlik (7,5 µl Mastermix, 1 µlTaq-polimeráz, 1,5 µl MgCl2µl, 3 µl primer mix és 1 µl dH2O ). Az eredeti leírásban 10 µl-ben ment végbe. A program egy úgynevezett „toch-down PCR”, ez azt jelenti, hogy a kezdeti denaturáló lépés után (ez 94°C –on 5 percig tart) ciklusonként 1°C-kal megy lejjebb az annelláció hőmérséklete (60-ról 50°C-ra).
A minták kiértékelése: 2, 5%-os etídium-bromidos agaróz gélen futtatjuk
a PCR termékeket. A tojóknál két csíkot (WZ), a hímeknél pedig egyet (ZZ)
lehet látni a legtöbb esetben. Néhány fajnál azonban előfordulhat, hogy
a kisebb méretű CHD1W intron sokkal nagyobb mértékben amplifikálódik,
és így a CHD1Z-termék nem lesz észrevehető, azaz tojók esetén is csak
egy csíkot lehet látni a gélen. Ilyen esetekben is egyértelműen el lehet
dönteni a nemet, mivel a termékek között 150-250bp különbség van. (CHD1W:
400-450bp; CHD1Z: 600-650bp). Emellett minden futtatásnál egy „biztos-hím”
és egy „biztos tojó” mintája is felkerül a gélre.
A képen 15 madár eredménye látszik (az 1-es és18-as zsebekben létrát futtattam, a 6-os pedig túl gyenge lett; X: üres zseb): a 9-es és 10-es madarak hímek, a többi minta pedig tojókból származott. A képen egyértelműen látszik a különbség a két ivar között, és az is, hogy a tojóknál nem minden estben amplifikálódott a hosszabbik fragmens (2-5; 11-17)
Felhasznált irodalom:
- Fridolfsson A. K. és Ellegren H. 1999 A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds - Journal of Avian Biology 30: 116-121
- Griffiths R. , Tiwari B. 1995 Sex of the last wild Spix’s macaw – Nature 375: 454
- R Griffiths and B Tiwari. (1993). Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18):
8324–8326
The Isolation of Molecular Genetic Markers for the Identification of Sex ingyenes - Ökológiai terepmódszerek: előadásanyag