Hibridizáció vizsgálata farkasok és kutyák között Lettországban mitokondriális és mikroszatellita DNS markerek használatával

Hotzi Virág

(genetika beadandó)

Probléma, célkitűzés

Napjainkban folytatott genetikai kutatások a morfológiai, etológiai és kromoszómális adatokat alapján olyan eredményre jutottak hogy a farkasok és a kutyák közeli rokonságban állnak, lévén a farkasok a házi kutyák ősei. A farkasoknak és kutyáknak hasonló kariotípusai vannak, lehetőség van köztük hibridizációra és nemzőképes utód létrehozására. A hibridizáció veszélye a vadonban magasabb olyan területeken, ahol a farkasok egyedszáma alacsony és kóbor kutyákkal kapcsolatba kerülhetnek (mint azt az etiópiai farkas (Canis simensis) esetében dokumentálták). A hibridizáció morfológiai, fiziológiai és viselkedésbeli változásokat okoz fogságban és vadon élő egyedeknél egyaránt, ezért a farkasok és a kóbor kutyák közti hibridizációt komoly figyelemmel kell követni az etológiai és a kezelhetőségbeni következmények miatt.

A háziasított gének hozzáadása veszélyezteti a vad egyedek génállományát.

Néhány esetben hibridizációt tapasztaltak Olaszországban, Oroszországban, Ukrajnába és más Beloruszi országokban is. Több kutatás és genetikai tanulmány szerint a kereszteződés kisebb valószínűségű a nyugat-európai területeken, gyakoribb a keleti régiókban.

Vila, randi és munkatársaik kutatásai kimutatták hogy a mtDNS szabályozó régió, az mtDNS CR (control regio), haplotípusokat határoz meg ami különbözik a legtöbb európai farkaspopulációnál, ill különbözik az eddig tanulmányozott kutyafajtákétól. Ezáltal fel lehet őket használni genetikai markerként a kutya-farkas hibridizáció feltárására.

Kelet-Lettországban először 1971-ben figyeltek meg farkas-kutya hibridizációt átmeneti jellegekkel bíró állatoknál. A 90-es években a vadászok többször láttak ilyen küllemű egyedeket. A kutatás célja az volt hogy megállapítsák a lettországi farkasok genetikai állományát és genetikai markerek használatával dokumentálják a farkas-kutya hibridizáció előfordulását.

Módszerek

A farkas Lettországban vadászható a populáció szabályozásának érdekében. 1997-99 között kb 800 farkast lőttek le. A vadászoknak be kellett jelentenie a lelőtt farkast és a vizsgálat céljából mintát kellett szolgáltatniuk. Ehhez a kutatáshoz 31, erre alkalmas izomszövetmintát vettek. 1999 márciusában 7 kölyökből álló almot találtak Észak-Lettországban. A kölykök különböző színűek voltak, ami a hibridizációra utalt. 6 kölyök szürke, 1 pedig fekete volt. A kölykök többségének lógó füle, négynek közülük 5 ujja volt legalább az egyik hátsó lábán, 1 kölyöknek pedig 6 ujja volt. Vérmintát vettek a 6 kölyöktől és a potenciális anyától, egy farkasszerű nősténytől, amelyen szoptatásra utaló jeleket találtak, illetve a potenciális apától, amely rendellenes színű volt Mindkettőt azon a környéken lőtték, ahol a hibrid kölyköket találták. A nőstény koponyája kutyaszerű jellegeket mutatott. További 6 farkas esetében merült fel a hibridizáció gyanúja az abnormális morfológiai jegyek miatt (szőrszín, kutyaszerű koponya). Kb 30-50 mg izommintából vonták ki a DNS-t, továbbá minden vérminta 100 mikroliterjéből vontak ki DNS mintákat. A tartósítás100%-os etanolban, 20 fokon történt.

A PCR-t Perkin Elmer 9600-as hőcentrifugába végezték, L-Pro és H-Phe primereket használtak. A termékeket Gene Clean agarózgéllel tisztították, majd elektroforézissel megvizsgálták.

A szekvenciákat az európai farkasokból származó mtDNS CR haplotípusok szerint sorba állították. Egyéni genotípusokat határoztak meg 16 mikroszatellita vizsgálatával, melyek kutyákból származtak és amelyek kissé eltérő formában a farkas-populációkban is megtalálhatók

Ezeket a mikroszatellitákat ismét PCR-rel felszaporították és szekvenátorral analizálták

Az egyedek mikroszatellita szekvenciáit KINSHIP1.2 programmal vizsgálták.

Eredmények

MtDNS CR haplotípusok a lett mintákban

A fenotípusokat alapul véve 19 farkast találtak tisztának, 6 esetében felmerül a hibridizáció gyanúja, és 6 esetében bizonyítottan hibrid volt az egyed. Ezekből a mintákból kivettek kb 294 nukleotidot az mtDNS CR variábilis részéből, melyeket ezután sorba állították és hozzáadták a kutya mtDNS CR szekvenciájához. A törzsfa filogenetikus kapcsolatot mutatott a két szekvencia között, mutatva hogy a 19 tiszta farkastól származó szekvenciák két különböző farkascsoport haplotípusaihoz kapcsolódnak. Az első ilyen csoport kapcsolatban áll más kutya és farkas szekvensekkel, a másik pedig csak farkas-haplotípusokat tartalmazott. A 6 hibrid kölyök egyedi mtDNS CR szekvenciát mutatott, amely megegyezett más lettországi farkas haplotípusával, ami azt feltételezi hogy az anyjuk farkas volt, mivel az ő mtDNS CR-je megegyező volt a kölykökével. Az a hím, amit a lehetséges hibrid apának véltek egyedi haplotípust mutatott, amely egyik farkaséval sem egyezett meg és rokonságot mutatott az alapfajhoz kapcsolódó lettországi farkasokkal. A másik 4 lehetséges hibrid két különböző mtDNS haplotípust mutatott: az első (3 farkas esetében) megegyezett a hibrid kölykök haplotípusával, a második olyan csoportba tartozott, melyben csak kutya-haplotípusok vannak, emiatt a szerzők úgy gondolják, hogy az utóbbi csoport mindenképpen háziasított eredetű.

A mikroszateliták variabilitása és a genotípus meghatározása

A vizsgált mintákat 95 kutyából származóval hasonlították össze. A hibrid kölykök mintáiban olyan allélokat találtak, amelyek csak kutyák mintáiban voltak jelen, viszont a lett farkasokéban nem. Emellett olyan allélok is szerepeltek, amelyek ezzel ellentétben farkasoknál igen, kutyáknál nem fordultak elő. Ezzel bizonyítják a kölykök hibrid eredetét. A vizsgált egyedek és a kutyák szekvenciája alapján meghatározták, hogy hányadrészt tartoznak a kutya és farkas csoportba.

Három feltételezett hibrid mtDNS haplotípusa a farkas-szekvenciának felelt meg, eszerint a farkas csoportba sorolható. Egy másik feltételezett hibridet, pedig a kutyákhoz soroltak, de ebben az esetben feltételezték, hogy vagy hibrid, vagy egy kóbor kutya került az ősei közé. A feltételezett anya és apa megközelítőleg fele-fele részben tartoztak a két kategóriába.

A rokonsági kapcsolatokat KINSHIP-pel vizsgálva a korábban feltételezett anya és a kölykök között nagy valószínűségű a szülő-utód kapcsolat. Ezt a mikroszatellita adatok is alátámasztják. A feltételezett apa esetén nem mutattak ki rokonsági kapcsolatot.

Összefoglalás

A kevés meglévő adat miatt nincsenek pontos információk a farkas-kutya hibridizáció mértékéről. A vizsgálat eredményei szerint a hibridizáció veszélyt jelent a vadon élő farkas-populációra, legalábbis Lettország néhány területén.

Hallgatói dolgozatok		Behaviour Server: http://www.behav.org
Student essays		Kabai Péter
		advice on essay

Hibridizáció vizsgálata farkasok és kutyák között Lettországban mitokondriális és mikroszatellita DNS markerek használatával Hotzi Virág (genetika beadandó) Probléma, célkitűzés Napjainkban folytatott genetikai kutatások a morfológiai, etológiai és kromoszómális adatokat alapján olyan eredményre jutottak hogy a farkasok és a kutyák közeli rokonságban állnak, lévén a farkasok a házi kutyák ősei. A farkasoknak és kutyáknak hasonló kariotípusai vannak, lehetőség van köztük hibridizációra és nemzőképes utód létrehozására. A hibridizáció veszélye a vadonban magasabb olyan területeken, ahol a farkasok egyedszáma alacsony és kóbor kutyákkal kapcsolatba kerülhetnek (mint azt az etiópiai farkas (Canis simensis) esetében dokumentálták). A hibridizáció morfológiai, fiziológiai és viselkedésbeli változásokat okoz fogságban és vadon élő egyedeknél egyaránt, ezért a farkasok és a kóbor kutyák közti hibridizációt komoly figyelemmel kell követni az etológiai és a kezelhetőségbeni következmények miatt. A háziasított gének hozzáadása veszélyezteti a vad egyedek génállományát. Néhány esetben hibridizációt tapasztaltak Olaszországban, Oroszországban, Ukrajnába és más Beloruszi országokban is. Több kutatás és genetikai tanulmány szerint a kereszteződés kisebb valószínűségű a nyugat-európai területeken, gyakoribb a keleti régiókban. Vila, randi és munkatársaik kutatásai kimutatták hogy a mtDNS szabályozó régió, az mtDNS CR (control regio), haplotípusokat határoz meg ami különbözik a legtöbb európai farkaspopulációnál, ill különbözik az eddig tanulmányozott kutyafajtákétól. Ezáltal fel lehet őket használni genetikai markerként a kutya-farkas hibridizáció feltárására. Kelet-Lettországban először 1971-ben figyeltek meg farkas-kutya hibridizációt átmeneti jellegekkel bíró állatoknál. A 90-es években a vadászok többször láttak ilyen küllemű egyedeket. A kutatás célja az volt hogy megállapítsák a lettországi farkasok genetikai állományát és genetikai markerek használatával dokumentálják a farkas-kutya hibridizáció előfordulását. Módszerek A farkas Lettországban vadászható a populáció szabályozásának érdekében. 1997-99 között kb 800 farkast lőttek le. A vadászoknak be kellett jelentenie a lelőtt farkast és a vizsgálat céljából mintát kellett szolgáltatniuk. Ehhez a kutatáshoz 31, erre alkalmas izomszövetmintát vettek. 1999 márciusában 7 kölyökből álló almot találtak Észak-Lettországban. A kölykök különböző színűek voltak, ami a hibridizációra utalt. 6 kölyök szürke, 1 pedig fekete volt. A kölykök többségének lógó füle, négynek közülük 5 ujja volt legalább az egyik hátsó lábán, 1 kölyöknek pedig 6 ujja volt. Vérmintát vettek a 6 kölyöktől és a potenciális anyától, egy farkasszerű nősténytől, amelyen szoptatásra utaló jeleket találtak, illetve a potenciális apától, amely rendellenes színű volt Mindkettőt azon a környéken lőtték, ahol a hibrid kölyköket találták. A nőstény koponyája kutyaszerű jellegeket mutatott. További 6 farkas esetében merült fel a hibridizáció gyanúja az abnormális morfológiai jegyek miatt (szőrszín, kutyaszerű koponya). Kb 30-50 mg izommintából vonták ki a DNS-t, továbbá minden vérminta 100 mikroliterjéből vontak ki DNS mintákat. A tartósítás100%-os etanolban, 20 fokon történt. A PCR-t Perkin Elmer 9600-as hőcentrifugába végezték, L-Pro és H-Phe primereket használtak. A termékeket Gene Clean agarózgéllel tisztították, majd elektroforézissel megvizsgálták. A szekvenciákat az európai farkasokból származó mtDNS CR haplotípusok szerint sorba állították. Egyéni genotípusokat határoztak meg 16 mikroszatellita vizsgálatával, melyek kutyákból származtak és amelyek kissé eltérő formában a farkas-populációkban is megtalálhatók Ezeket a mikroszatellitákat ismét PCR-rel felszaporították és szekvenátorral analizálták Az egyedek mikroszatellita szekvenciáit KINSHIP1.2 programmal vizsgálták. Eredmények MtDNS CR haplotípusok a lett mintákban A fenotípusokat alapul véve 19 farkast találtak tisztának, 6 esetében felmerül a hibridizáció gyanúja, és 6 esetében bizonyítottan hibrid volt az egyed. Ezekből a mintákból kivettek kb 294 nukleotidot az mtDNS CR variábilis részéből, melyeket ezután sorba állították és hozzáadták a kutya mtDNS CR szekvenciájához. A törzsfa filogenetikus kapcsolatot mutatott a két szekvencia között, mutatva hogy a 19 tiszta farkastól származó szekvenciák két különböző farkascsoport haplotípusaihoz kapcsolódnak. Az első ilyen csoport kapcsolatban áll más kutya és farkas szekvensekkel, a másik pedig csak farkas-haplotípusokat tartalmazott. A 6 hibrid kölyök egyedi mtDNS CR szekvenciát mutatott, amely megegyezett más lettországi farkas haplotípusával, ami azt feltételezi hogy az anyjuk farkas volt, mivel az ő mtDNS CR-je megegyező volt a kölykökével. Az a hím, amit a lehetséges hibrid apának véltek egyedi haplotípust mutatott, amely egyik farkaséval sem egyezett meg és rokonságot mutatott az alapfajhoz kapcsolódó lettországi farkasokkal. A másik 4 lehetséges hibrid két különböző mtDNS haplotípust mutatott: az első (3 farkas esetében) megegyezett a hibrid kölykök haplotípusával, a második olyan csoportba tartozott, melyben csak kutya-haplotípusok vannak, emiatt a szerzők úgy gondolják, hogy az utóbbi csoport mindenképpen háziasított eredetű. A mikroszateliták variabilitása és a genotípus meghatározása A vizsgált mintákat 95 kutyából származóval hasonlították össze. A hibrid kölykök mintáiban olyan allélokat találtak, amelyek csak kutyák mintáiban voltak jelen, viszont a lett farkasokéban nem. Emellett olyan allélok is szerepeltek, amelyek ezzel ellentétben farkasoknál igen, kutyáknál nem fordultak elő. Ezzel bizonyítják a kölykök hibrid eredetét. A vizsgált egyedek és a kutyák szekvenciája alapján meghatározták, hogy hányadrészt tartoznak a kutya és farkas csoportba. Három feltételezett hibrid mtDNS haplotípusa a farkas-szekvenciának felelt meg, eszerint a farkas csoportba sorolható. Egy másik feltételezett hibridet, pedig a kutyákhoz soroltak, de ebben az esetben feltételezték, hogy vagy hibrid, vagy egy kóbor kutya került az ősei közé. A feltételezett anya és apa megközelítőleg fele-fele részben tartoztak a két kategóriába. A rokonsági kapcsolatokat KINSHIP-pel vizsgálva a korábban feltételezett anya és a kölykök között nagy valószínűségű a szülő-utód kapcsolat. Ezt a mikroszatellita adatok is alátámasztják. A feltételezett apa esetén nem mutattak ki rokonsági kapcsolatot. Összefoglalás A kevés meglévő adat miatt nincsenek pontos információk a farkas-kutya hibridizáció mértékéről. A vizsgálat eredményei szerint a hibridizáció veszélyt jelent a vadon élő farkas-populációra, legalábbis Lettország néhány területén.

Notes (if any) by Peter Kabai: