A vizsgálati eredmények terebélyesedésével két módszertani és egy fontos elmélet kérdést kellett megválaszolni. A módszertani kérdések a körül forogtak, hogy az elektroforézissel mért genetikai változatosság milyen hűen tükrözi a teljes genom variabilitását, az elméleti kérdés pedig az volt, hogy mit is jelent evolúciós szempontból a genetikai variabilitás meglepően magas értéke.

A tényleges fehérjeváltozatok milyen arányban mutathatók ki elektroforézissel?

Az elektroforézis a fehérjéket töltésük alapján választja el. A töltés megváltozásának feltétele olyan mutáció, amelynek hatására a fehérje egy pontján lévő aminosav eltérő töltésű aminosavra cserélődik ki. A DNS-ben történő pontmutációknak azonban csak kis része okoz ilyen változást, következtetésképpen a hagyományos elektroforézissel a tényleges genetikai variabilitásnak csak kis része mutatható ki. A technikát többen, több módon továbbfejlesztették. A legfontosabb újítás talán a kétdimenziós elektroforézis bevezetése volt. Ennek lényege, hogy a fehérjéket az egyik irányban töltésük alapján választották el, a másik irányban pedig -csökkenő pórusméretű futtató közeg alkalmazásával- a molekula mérete szerint történt a szétválasztás. A sokféle újítással az addig monomorphnak mutatkozó fehérjék egy részében is sikerült változatokat kimutatni, nehézséget jelentett azonban, hogy minél bonyolultabbá vált a technika, annál nehezebben voltak az eredmények a mendeli öröklésmenet alapján értelmezhetőek.

Az elektroforézissel vizsgált fehérjék milyen hűséggel tükrözik a teljes genom variabilitását?

Az elektorforézises vizsgálatok érthető módon olyan fehérjék kimutatására irányulnak, amelyeknek festése egyszerű eszközökkel, olcsón megoldható volt. Ezek elsősorban enzimek voltak, ezen belül is néhány típusú enzim (pl. a citrát kör enzimjei). A sok fajban vizsgált 20-50 lokusz így csak kicsi mintáját jelentik a lehetséges sok ezer génnek. A kérdés az, hogy az elektroforézissel vizsgált fehérjék csoportja jó minta-e a teljes genomra. Ennek eldöntésére felhasználták a már ismertetett két-dimenziós gél-elektroforetikus elválasztást, mert ezzel sok, nem enzim természetű membránhoz kötött fehérje is kimutatható. Számos faj ilyen vizsgálata alapján úgy tűnt, hogy a struktúr fehérjék polimorfizmusa nem közelíti meg az enzimekét. Mielőtt azonban újabb vita lángolt volna föl a polimorfizmus valódi mértékével kapcsolatban, újabb, hatékony DNS szintű technikák váltak elérhetővé. A DNS közvetlen vizsgálata végérvényesen igazolta, hogy a természetes populációk genetikai változatossága valóban magas értéket mutat.

Fehérje polimorfizmus vizsgálati módszerek

A fehérjék genetikailag eltérő változatainak, a fehérje polimorfizmus vizsgálatának óriási jelentősége volt a populációgenetika fejlődése szempontjából. Az 1960-as évektől kezdődően egészen napjainkig rengeteg adat gyűlt össze a természetes populációk genetikai szerkezetéről. Ennek hatására ma másképpen látjuk az evolúciós folyamatokat, mint amikor hasonló minőségű kvantitatív adatok nem álltak rendelkezésre. A fehérje szintű módszerek egyedülálló jelentősége mára megszűnt, olcsóságuk és egyszerűségük miatt azonban még ma is használatosak.

A fehérje minták forrása és a minta tárolása

Eltérő szövetekben eltérő fehérjék fordulhatnak elő, ezért a mintavétel módja a fehérje polimorfizmus vizsgálatokban jóval fontosabb, mint a DNS szintű vizsgálatokban. Gerincesekből leggyakrabban vért használnak, de feldolgozásra természetesen egyéb szövetek (pl. szívizom, máj) is alkalmasak.

A fehérjék tárolása nagy körültekintést igényel. A strukturfehérjék egy része elég ellenálló, pl. a hemoglobin polimorfizmus beszáradt vérmintákban is detektálható. Enzimatikus aktivitásukat azonban a fehérjék hamar elveszítik, ha a tárolás nem megfelelő. Célszerű a mintát megfelelő kezelés (homogenizálás, centrifugálás) után azonnal lefagyasztani. A legtöbb fehérje -20⁰C-on hosszú hónapokig, -60⁰C-on akár évekig eltartható károsodás nélkül.

Fehérje polimorfizmus vizsgálatok

A különböző töltésű, méretű fehérjemolekulák megfelelő közegben, elektromos erőtérben eltérő sebességgel haladnak. Azonos funkciójú allélikus fehérjék akkor választhatók szét, ha a mutáció következtében olyan aminosavcsere történt, amely megváltoztatta a fehérje nettó töltését. Az elektromos erőtérben való szétválasztási technikák közös neve: elektroforézis.

Az egyes módszerek különböznek aszerint, hogy milyen vivő közeget alkalmaznak. Egyszerűsége miatt nagyon elterjedt a poliakrilamid gél (poliakrilamid gél-elektroforézis, PAGE), de használnak keményítő és agaróz gélt, vagy cellulóz acetátot is vivő anyagként. Az egyes módszereket nem ismertetjük külön, azonban egyet közülük részletesebben bemutatunk, hogy demonstráljuk a módszer viszonylagos egyszerűségét.

Egy egyszerű PAGE készülék bármely laborban "összebarkácsolható". Két egyforma méretűre vágott, csiszolt szélű üveglap közé egy fél-1 mm vastag U alakú műanyag keretet helyezünk, és a lapokat papírcsipesszel összefogjuk. A két lap közé öntjük a gélt, amelynek polimerizációja után az egyik lapot eltávolítjuk. A mintákat legegyszerűbben úgy vihetjük fel, ha egy-egy kicsi téglalap alakú szűrőpapírt mártunk minden mintába, majd a csíkokat egy vonalzó mentén egy vonalban felhelyezzük a gél egyik végére.

Ezután az alsó üveglap két végét két pufferkádra helyezzük, a kádban lévő puffert a géllel egy-egy nedves ablaktisztító szivaccsal összekötjük, és a gélt egy műanyagfóliával lefedjük, hogy ne száradjon ki a futtatás alatt. Az alkalmazott magas feszültség miatt a gélt hatékonyan kell hűteni futtatás közben. Megfelelő hűtőlap hiányában a gélt felülről, műanyagzacskóba helyezett jég akkuval is hidegen tarthatjuk.

Az előkészítés után a gélt a pufferkádakon keresztül egy tápegység segítségével 400-800 V egyenfeszültség alá helyezzük. Gondoskodnunk kell arról, hogy futtatás közben még véletlenül se érjen senki a feszültség alatt álló rendszerhez. Kb. 4-8 órás futtatási idő után a tápegység kikapcsolható, és a szétvált csíkok megfesthetőek. A mintában nagy mennyiségben előforduló fehérjék (pl. hemoglobin, transzferrin) egyszerű fehérje festéssel (pl. Coomassie Blue) kimutathatóak. A csak nyomokban jelenlévő enzimek specifikus festését megfelelő szubsztrátokkal való inkubálás után lehet elvégezni.

A poliakrilamid gélek festés után szárítással megőrizhetőek. A szárítást célszerű alkoholos kezeléssel kezdeni, hogy megakadályozzuk a gyors dehidratáció okozta repedést. Egy jól bevált recept: áztassuk a gélt 30%-os etanolban 30-50 percig, ezután helyezzük két befőttes celofánlap közé és csipeszekkel rögzítsük egy üveglaphoz. Száraz helyiségben nem árt a lapokat párásított inkubátorban szárítani 2-3 napon át.

A vivőanyag pórusméretének változtatásával lehetséges molekulák méret szerinti elkülönítése is. Leghatékonyabb erre a célra az, ha a poliakrilamid gél sűrűsége adott grádiens mentén folyamatosan növekedik. A mintát a gél nagy pórusméretű végére visszük fel. A fehérjemolekulák a gélben addig jutnak el, ameddig meg nem akadnak gél egyre kisebb pórusai között.

Az elektromos töltés illetve a méret szerinti elkülönítést gyakran kombinálják az un. kétdimenziós PAGE-ban. Ilyenkor a mintát először nagypórusú gélben futtatják, majd az elektromos töltés szerint szétválasztott csíkokat sűrűség gradiens mentén újra futtatják. Az eredmény sokszáz elkülönült fehérje pötty a gélben, ami nagyon sok információt hordoz, azonban nehezen értékelhető.

Több mint 100 enzim futtatására és festésére van recept. Az átlagos populáció-vizsgálatokban 10-30 enzim polimorfizmusát vizsgálják, ezek 15-50 génnek felelnek meg. Nem ritkán több száz, akár ezer egyedből is vesznek mintát. Megjegyzendő, hogy a populációk struktúrájának felderítéséhez (pl. szubpopulációk közötti genetikai távolságok mérése) megbízhatóbb adatot ad kevesebb egyedből több polimorf lokusz vizsgálata, mint ha kevés lokuszt elemzünk nagyon sok egyedi minta alapján.

A fehérjecsík mintázat (zymogram mintázat) többnyire mendeli öröklésmenetet mutat. A mendeli öröklésmenet bizonyítására azonban szükség van, mert számos tényező (pl. a fehérjék kismértékű bomlása) artefakt csíkokat eredményezhet, de technikai gondok miatt előfordulhat az is, hogy egyes csíkok nem jelennek meg a gélben. A mendeli öröklésmenet bizonyítható keresztezési kísérletekkel. A feltételezett homozigóta mintázatot mutató egyedek keresztezhetők, az utódok pedig visszakeresztezhetők a szülőkre. Az 1960-as évektől kezdve számos enzimre több fajban elvégeztek ilyen vizsgálatokat.

Sok esetben pontosan ismert a kérdéses enzim molekula szerkezete és az enzim kódolásában részt vevő gének száma. A biokémiai ismeretek alapján, különösen ha nem távoli rokonfajon régebben keresztezési kísérleteket is végeztek, nagy biztonsággal azonosíthatóak az egyes allélek a gélben. Fontos információ például az, hogy a kérdéses enzim molekula hány egységből épül fel, és hogy az egységeket hány lokusz kódolja.

A csíkmintázat elemzése tehát bár elvileg egyszerű, nagyon körültekintően kell végezni, hogy az allélváltozatokat, és a kódolásban esetleg szerepet játszó gén duplikátumukat megfelelően értékeljük.

A fehérje gél-elektroforézis szolgáltatta a legelső mendeli öröklésmenetet mutató polimorf bélyegeket, amelyek a populációkban nagyobb számban voltak vizsgálhatók. Ennek tudománytörténeti jelentősége abban áll, hogy a gél-elektroforézis technikával nyert adatok bizonyították először a természetes populációkban a magasfokú genetikai variabilitás jelenlétét. Az érzékenyebb DNS technikák megjelenése után sem szorultak ki a kutatásból a fehérje polimorfizmus vizsgálatok.