A következőkben áttekintjük azokat a DNS és fehérjevizsgálati
módszereket, amelyeket a leggyakrabban használnak populáció-
illetve evolúciógenetikai vizsgálatokban. Mivel ez a terület
a biológia leggyorsabban fejlődő ága, a felsorolt módszerek
némelyikét jóval hatékonyabb eljárások válthatják fel a közeli
jövőben. A tendencia jól kitapintható: a technika a kis mintamennyiség
hatékony, olcsó és biztonságos feldolgozása irányában fejlődnek.
Néhány éven belül várhatóak a miniatürizált, automatizált, nem
rádióaktív technikák ("amit az orvos is meg tud csinálni a rendelőben")
megjelenése.
1. DNS technikák
Míg az 1970-80-as években a populációk genetikai feltérképezését
elsősorban a fehérjék polimorfizmusa alapján végezték, mára
az egyszerűbb feladatokat is egyre gyakrabban DNS szintű technikákkal
oldják meg. Ennek oka az, hogy a DNS technikák ma már kis mennyiségű
mintából, gyorsan és viszonylag olcsón nagy tömegű, közvetlen
adatokat szolgáltatnak a genetikai variációkról.
A technikák elnevezése megtévesztő lehet. Amikor egy új módszert
bevezetnek, mint pl. a DNS-DNS hibridizációt, vagy a restrikciós
enzimekkel való hasítást, akkor gyakran az egész eljárássorozatot
az újítás alapján nevezik el. Bár az új módszerek lényege egy
új trükk és elnevezésük is új, rendszerint mégis tartalmazzák
az előző módszerek fontos lépéseit is.
DNS szekvenálás és a polimeráz láncreakció (PCR)
A genetikai variancia teljessége végső soron a nukleotid szekvencia
alapján állapítható meg. A DNS szekvenálása azonban ma sem olcsó,
ezért a rutin populációgenetikai felmérésekben nem alkalmazzák.
A DNS bázisszekvencia leírásához manapság leggyakrabban az
1970-es években Sanger és mtsai által kidolgozott módszert használják,
egy új eljárással, a polimeráz láncreakció technikával kombinálva.
A Sanger-féle szekvenálás a DNS kettős szál denaturálásával
kezdődik. Az egyes szálakhoz egy rövid DNS szakasz másolatait
(primer) adják, ezek hozzákapcsolódnak a vizsgálandó DNS-hez.
A primer/templát keveréket négyfelé osztják, és mind a négy
részmintához DNS polimeráz enzimet adnak. A négy reakcióelegy
tartalmazza a szintézishez szükséges nukleotidokat (dA, dC,
dG és dT), továbbá az egyes részmintákhoz valamelyik nukleotid
típus módosított formáját is hozzáteszik. A módosított nukleotidnak
hiányzik a 3'-OH csoportja (didesoxinukleotid).
A DNS polimeráz a szintézist a primer szabad 3'-OH végénél
kezdi meg, a primerhez kapcsolva a nukleotidokat. Amennyiben
az enzim egy módosított nukleotidot kapcsol a szintetizálódó
lánchoz, a további szintézis leáll, mivel hiányzik a kiegészítéshez
szükséges szabad 3'-OH végződés. Mivel az egyes részminták vagy
ddA-t, vagy ddC-t, vagy ddG-t, vagy ddT-t tartalmaznak, a reakció
az egyes elegyekben a megfelelő dd-nukleotid beépülése után
áll le. A didesoxinukleotidok mennyiségét úgy választják meg,
hogy véletlenszerű beépülésük gyakorisága alacsony legyen. Ennek
megfelelően a szintetizálódó szakaszok hossza egy-egy reakcióelegyben
különböző lesz. A fragmentumok hosszúságuk alapján szétválaszthatók
gél-elektroforézisssel.
A négy reakcióelegyben a szintézis a négy különböző dd-nukleotid
beépülésénél áll meg. Mivel a gélekben a szakaszok hosszúságuk
szerint rendeződnek, a négy gélt egymás mellé helyezve a szekvencia
közvetlenül leolvasható. A leolvasáshoz a DNS szakaszokat láthatóvá
kell tenni, amit hagyományosan radioaktív jelöléssel oldottak
meg, azonban ma egyre gyakrabban használnak veszélytelen és
azonnali leolvasást biztosító jelöléseket.
A szekvenáláshoz a vizsgálandó DNS szakaszból nagy mennyiségre
van szükség. A DNS szakaszok felszaporításához ma a polimeráz
láncreakció módszert alkalmazzák. A DNS polimeráz enzim a DNS
egyetlen szála mentén megfelelő körülmények között, primer jelenlétében
komplementer szálat szintetizál. Az így létrejött kettős szálú
DNS-t denaturálva ismét két egyes fonál keletkezik, amelyek
mentén újból elindulhat a szintézis. A szintézis-denaturáció
ciklust ismételve a szintetizált DNS szakaszok száma exponenciális
gyorsasággal növekszik.
A polimeráz láncreakció módszer (Polymerase Chain-Reaction,
PCR) gyors kivitelezésére automatizált berendezéseket használnak.
A szükséges alapanyagokat (polimeráz enzim, primerek, a négy
nukleotid) nagy fölöslegben viszik az oldatba. A DNS-t rövid
idejű felmelegítéssel denaturálják (950C). A magas
hőmérséklet miatt egy hőtűrő organizmus, a gejzírforrásokban
honos Thermus aquaticus polimerázát alkalmazzák a PCR automatában.
Az amerikai Yellow Stone Nemzeti Park hőforrásaiban
élő mikroorganizmusok különös jelentőségre tettek szert a PCR
technika elterjedésével. A Park létrehozásakor természetesen
senki sem gondolhatott arra, hogy a terület védelmével egy modern
genetikai eljáráshoz szükséges mikroorganizmust is óvnak.
Lehűtés után (37 0C) a primerek a fonalakhoz kapcsolódnak,
és megkezdődik a szintézis. Egy ilyen denaturáció-szintézis
szakasz kb. 10 percig tart és 30 vagy még több cikluson keresztül
folytatható. Mivel minden ciklusban megduplázódik a másolatok
száma, 30 ciklus alatt 230, azaz kb. 109
-en új, az eredetivel megegyező szakasz képződik.
A PCR-ban felhasznált primer alkalmas a Sanger-féle szekvenálás
primerjének szerepére is, ezért a két módszer egyszerűen összekapcsolható.
A szekvenálás gyorsaságát növeli és munkaigényességét csökkenti,
hogy mindkét fázis nagymértékben automatizálható.
A PCR módszerben olyan primereket kell használni, amelyek képesek
a vizsgálandó DNS szakasz szárny részéhez kapcsolódni. Ilyen
rövid, 20-30 bp szekvenciákat nagy számban találtak az állati
mtDNS-ben, ezért nem véletlen, hogy a PCR módszerrel párosított
szekvenálási erőfeszítések, különösen az első időben a mitokondriális
DNS-re összpontosultak.
A DNS szekvencia minden olyan információt közvetlenül tartalmaz,
amelyet egyéb módszerek alkalmazásával csak korlátozott mértékben
és közvetve nyerhetünk. Az izoenzimek elektroforetikus szétválasztásával
pl. csak olyan báziskülönbségek észlelhetők, amelyek a fehérje
molekula töltésének megváltozását okozták. A DNS szekvenciák
összehasonlítása alapján ugyanakkor minden mutációtípus detektálható.
A Humán Genom Projekt, amely a teljes emberi genom szekvenálást
tűzte ki célul óriási tömegű információt szolgáltatott már eddig
is, megjegyezzük, hogy a projekt az emberi genom mellet az egér,
a Drosophila és a Caenorhabditis elegans genom teljes szekvenálást
is célul tűzte ki. A megfejtett szekvenciák számítógépes adatbázisba
kerülnek, és így könnyen hozzáférhetők minden kutató számára.
Rutin populációgenetikai vizsgálatokban azonban a szekvenálás
még nem terjedt el, aminek több oka van. A szekvenálás még ma
is túlságosan időigényes ahhoz, hogy sok egyedből vett mintát
lehessen analizálni. Gondot jelent az is, hogy a bázissorrend
megállapítása csak rövidebb szakaszokban (kb 500 bp) lehetséges,
így a vizsgálandó szakaszok hossza és száma is korlátozott.
A megfelelő primer megválasztásához előzetes információk szükségesek
a célszakasz szárnyszekvenciájáról is. Ez utóbbi gond jelentősége
csökken, amint egyre több fajból, egyre több gén szekvenciáját
feltárják.
A PCR alkalmazásának különösen akkor van jelentősége, amikor
kevés DNS minta áll rendelkezésre. Sikeresen alkalmazták a PCR
technikát pl. egyetlen tollból, szőrszálból vagy vércseppből
kivont DNS szekvenálására. A PCR-t ma már rutinszerűen alkalmazzák
a kriminológiai laboratóriumokban, ahol pl. egy levélpapírra
kenődött néhány hámsejt alapján próbálják a levélírót azonosítani.
PCR-ral erősítik fel a paleontológiai leletekben megmaradt kis
mennyiségű DNS-t, vagy a kihalt fajok múzeumi preparátumaiból
nyerhető néhány beszáradt sejtmag DNS tartalmát. Ez utóbbi törekvéseket
azonban sokan kritikus szemmel nézik. A PCR technika érzékenysége
ugyanis olyan nagyfokú, hogy a minta esetleges kicsiny szennyeződéseit
is felerősítheti. További aggodalomra ad okot a ciklikus felerősítés
során bekövetkező másolási hibák esetleges felszaporítása is.
Az eddigi vizsgálatok tanulsága azonban az, hogy a PCR ciklusok
során keletkező "mutációk" gyakorisága elhanyagolható a természetes
populációkban előforduló genetikai variabilitáshoz képest.
A szekvenciák összehasonlításának matematikai alapjaival később
foglalkozunk.
A polimorf DNS véletlenszerű felerősítése (RAPD)
Mivel az új DNS szakasz szintéziséhez megfelelő primer is szükséges,
a primer kiválasztásával lehetőség van arra, hogy a teljes DNS
molekulából egy adott DNS szakaszt szelektíven erősítsünk fel.
Az így nyert DNS mennyisége már lehetővé teszi a közvetlen elektroforetikus
vizsgálatot. A PCR módszer ezért önmagában is alkalmas bizonyos
polimorfizmus vizsgálatokra. Különböző fajok összehasonlíthatóak
pl. abból a szempontból, hogy mekkora a két primer közötti DNS
szakasz hossza, vagy hogy van-e eltérés az indító helyben.
Rövid primerek egyszerűen, nagy számban szintetizálhatóak.
E tetszőleges szekvenciájú mesterséges primerek közül lesznek
olyanok, amelyek a PCR során a vizsgálandó DNS valamilyen szakaszához
kötődnek és ezzel lehetővé teszik a láncreakció beindulását,
és lesznek olyanok, amelyek nem képesek az adott DNS-hez kötődni.
Az eltérő származású DNS molekulákban lehet eltérés abban, hogy
mely primerek képesek beindítani a láncreakciót. A termékeket
gél-elektroforézissel vizsgálva így az eltérő származású DNS
minták PCR termékeinek hossza különböző lesz, ami gél-elektroforézissel
detektálható. A tetszőleges primereket felhasználó PCR polimorfizmus
vizsgálat (Random Amplified Polimorfic DNA, RAPD, amit
angolul "rapid"-nek ejtenek) megbízhatóságát és alkalmazhatóságának
körét intenzíven kutatják. Populációgenetikai vizsgálatokra
a RAPD jelenleg még nem terjedt el.
Restrikciós fragmentum analízis (RFLP)
A genetikai polimorfizmusról kvantitatív adatok nyerhetők a
restrikciós fragmentumok hosszának elemzésével (restriction
fragment length polimorphism, RFLP, amit angolul "riflip"-nek
ejtenek). A restrikciós enzimek a DNS fonálban meghatározott
szekvenciájú 4-8 nukleotid nagyságú szakaszt (restriction
site) ismernek fel, és a DNS szálat e szakasz meghatározott
pontján hasítják. Amennyiben két DNS szál szekvenciája tökéletesen
megegyezik, akkor a restrikciós enzimkezelés után minden darab
hossza is azonos lesz. Ha azonban két DNS molekula akár csak
egyetlen bázisban különbözik a hasítási helyen, akkor az enzim
ezen a szakaszon nem hasítja az egyik DNS-t, és a két DNS minta
között különbség lesz a keletkező fragmentumok hosszában.
A DNS szakaszok méretük alapján elkülöníthetőek. A mintát restrikciós
enzim kezelés után egy gélre viszik fel, és a gélt elektromos
erőtérbe helyezik néhány órára. Mivel a különböző hosszúságú
szakaszok elektromos erőtérben különböző sebességgel haladnak,
a feszültség kikapcsolása után a különböző méretű szakaszok
különböző távolságra állnak meg a kiindulási ponttól. A szakaszok
ezután megfesthetőek, de gyakoribb, hogy a szakaszokat meghatározott
szekvenciákkal hibridizáltatják. A hibridizációhoz a szakaszokat
egy filter membránra kell átvinni a gélről (Southern blotting).
A restrikciós enzimeket különböző baktériumtörzsekből vonják
ki. A baktériumban a restrikciós enzim védi a genomot idegen
DNS szakaszok beépülésétől. A restrikciós enzim ugyanis csak
a metilálatlan DNS-t vágja el, ami a bakteriális DNS-ből egy
speciális metilációs rendszer működésének következtében nincs
jelen. Az Escherichia coli-ból kivont restrikciós enzim, az
EcoRI például a kettős szálú DNS minden olyan ponton széthasítja,
ahol a GAATTC-3' szekvencia nem metilált formában előfordul.
Jelenleg több száz különböző szekvenciák mentén hasító restrikciós
enzim áll a genetikusok rendelkezésére.
Az RFLP technika különböző származású (pl. mitokondriális,
riboszomális, nukleáris) DNS-re, illetve különböző jellegű DNS
szakaszokra (gének, repetitiv szekvenciák) alkalmazható. A módszer
elvileg azonos minden esetben, de az adatok jellege a DNS jellegétől
függően nagyon eltérő lehet, ezért röviden áttekintjük a főbb
DNS mintákat.
RFLP: állati mitokondriális DNS
A mDNS kinyerése több lépésben történik: alacsony fordulatszámú
centrifugálással elválasztják a citoplazmát és a magot, magasabb
fordulaton pedig kiülepítik a mitokondriumot a citoplazmából.
Egy újabb, hosszan tartó gradiens centrifugálás után a mitokondriális
DNS különálló csíkban gyűlik össze a gradiensben, ezt egy tűvel
kiemelik, majd dialízissel tisztítják. A DNS minta tisztításának
időigényét gyakorlatilag a gradiens centrifugálás szabja meg,
mert ez akár két napot is igénybe vehet.
Az egyedenként kinyert mtDNS-t restrikciós enzimekkel kezelik,
és az így nyert fragmentumok végéhez radioaktív jelzést kapcsolnak,
majd elektroforetikusan szétválasztják a szakaszokat nagyság
szerint.
Az állati mtDNS kör alakú molekula, rendszerint 15-20 kb hosszúságú,
és általában 37 gént tartalmaz, amelyek 22 tRNS-t, 2 rRNS-t
és 13 mRNS-t kódolnak. Ez utóbbiak az elektrontranszportban
és az oxidatív foszforilálásban szerepet játszó fehérjék szekvenciáját
határozzák meg. Ezeken kívül a mtDNS tartalmaz egy kb. 1 kb
hosszúságú régiót is, amely a replikációt és transzkripciót
szabályozza (control region = CR). A mtDNS -ben a gének elrendeződése
a különböző állatfajokban szinte azonos, bár találtak bizonyos
különbségeket is. A mtDNS szinte teljes egészében kódoló szakaszokból
áll: az intronok, repetitiv szekvenciák, pszeudogének és egyéb
nem kódoló szakaszok nagyon ritkák, többnyire teljesen hiányoznak.
A mitokondrium ugyanakkor nem tartalmaz replikációs javító
rendszert, valószínűleg ennek következményeként az azonos fajba
tartozó egyedek között viszonylag nagy lehet a különbség a mtDNS
szekvenciájában. A különbséget pontmutációk okozzák, amelyek
között a tranzíciók gyakorisága jóval meghaladja a transzpozíciókét.
Egy egyeden belül ugyanakkor a mtDNS szinte teljesen homogén.
Populációgenetikai vizsgálatok szempontjából különleges jelentősége
van annak, hogy a fajok túlnyomó többségében a mitokondrium,
és így a mtDNS is a petesejtből, tehát kizárólag az anyától
származik. Van néhány kivétel, néhány tengeri kagylófajban pl.
kimutatható volt az apai mitokondriumok jelenléte is, de itt
sem figyeltek meg az apai és anyai mtDNS között rekombinációt,
tehát a kétféle mtDNS egymástól függetlenül vizsgálható. A nem
rekombinálódó anyai származású mtDNS-t tekinthetjük olyan klónnak,
amely aszexuálisan adódik át generációról generációra. Így a
mtDNS alapján felvett genetikai távolságok alapján egy "matriarchális
családfa" állítható fel.
Az emberi mDNS összehasonlító vizsgálata alapján
dolgozták ki a később részletesen ismertetett "Mitochondriális
Éva" hipotézist. Különböző rasszok egyedeiből vett minták összehasonlítása
alapján ugyanis következtethetünk arra, hogy az eredeti mtDNS
milyen volt, mennyi idő telhetett el a különbségek kialakulásáig,
és hogy a ma élő rasszok közül melyik őrzi leginkább az eredeti
mtDNS szekvenciáját. E vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy a
mai mtDNS változatok visszavezethetők egyetlen közös ős szekvenciára
és az ezt hordozó egyedek Afrikában éltek.
A populációgenetikai vizsgálatokban általában 10-20 különböző
restrikciós enzimet használnak, amelyek rendszerint 5 vagy 6
bp szekvenciákat ismernek és vágnak fel. Egyedenként általában
50-100 restrikciós fragmentet nyernek, ami összességében 250-600
bp hosszúságú szekvencia vizsgálatának feleltethető meg (pl.
ha 5 bp mentén hasító enzimek használata 50 fragmentumot eredményez,
akkor ez összesen 5 x 50 = 250 bp). Egyszerűbb esetben, pl.
azonos faj egyedeinek összehasonlításakor, a genetikai különbségek
a szétválasztott fragmentumok hossza alapján, a gélcsíkok mintázatából
közvetlenül becsülhető. Az adatokat szokás egy bináris mátrixban
is feltüntetni, ahol a hasítás meglétét illetve hiányát jelzik.
Táblázat: Restrikciós helyek jelenléte (.), illetve hiánya
(0) egy verébfaj (Ammodramus caudatus) egyedeinek mtDNS-ében.
Az eredeti vizsgálatban összesen 107 egyedet vizsgálva 20 különböző
haplotípust találtak. A haplotípusok közül tüntettünk fel néhányat
a sorokban úgy, hogy a teljes sornak csak az első felét írtuk
fel (Rising és Avise, 1993 után).
a +++++++++++00+0+++++++0++++0+++++++++++++++0+0++++++0+
b +++++++++++00+++++++++0++++0+++++++++++++++0+0++++++0+
c +++++++++++00+0++++++++++++++++++++++++++++0000+++++++
d +++++++++++00+0+++++++++++++++++++++++++++++000+++++++
e +++++++++++00+0+++++++0++++++++++++++++++++0000+++++++
A mtDNS RFLP-t többnyire egy fajhoz tartozó egyedek vizsgálatára
használják. Fajok közötti összehasonlításra, tehát amikor jelentős
különbségek lehetnek az eltérő mtDNS minták között, a mtDNS
fragmentum mintázatot csak kellő óvatossággal lehet értékelni.
Evolúciós törzsfák rekonstrukciójára azonban jól használhatóak
a mtDNS szekvencia adatok, a tRNS illetve rRNS szerkezetében,
a gének elrendeződésében jelentkező változások.
RFLP: Nukleáris gének (scnDNS)
A nukleáris gének (single copy nuclear DNA = scn DNA) RFLP
vizsgálatának feltétele, hogy a cél DNS szakasz elegendő kópiában
legyen jelen. Kópiák többféle módszerrel előállíthatók. A teljes
nDNS restrikciós hasítás után megfelelő vektorban klónozható.
Egy kérdéses gént mRNS-einek reverz transzkripciójával előállított
cDNS szakasz alapján is lehet vizsgálni. Ez utóbbi módszer előnye,
hogy egy adott funkcióhoz nagy mennyiségben termelődő mRNS elválasztásával
a funkcióban szerepet játszó DNS szakaszt lehet azonosítani.
A mRNS-ről visszafordított cDNS azonban processzált szekvencia,
amely nem tartalmazza a gén eredeti intronjait. Populációgenetikai
vizsgálatokban ez hátrány lehet, mert gyakran a nem kódoló intron
szakaszok evolúciója gyorsabb, és így nagyobb polimorfizmust
mutatnak mint az exonok.
Nemrégiben kidolgozták a polimeráz láncreakció (PCR) módszert
az scnRFLP-hez. A DNS könyvtárban azonosítják az egyedi kópia
szekvenciákat, ezeket PCR-ral szaporítják fel, majd a szekvenciákat
restrikciós enzimekkel emésztik. A fragmentumokat elektroforézissel
választják el, és festéssel teszik láthatóvá. A PCR technikának
számos előnye van a hagyományos Southern blotting technikával
szemben: kevés minta is elegendő, így kisméretű organizmusok
DNS-e is egyedileg vizsgálható, előny az is, hogy a PCR-ral
felerősített szakaszok hossza egyenlő (a primerek közötti távolság
határozza meg a hosszt).
A mitokondriális DNS RFLP-hez hasonlóan a scnDNS RFLP-je valódi
mendeli öröklésmenetet követő polimorfizmusokat mutat ki az
enzimek által felismert rövid szakaszokon. Az állati nDNS-ben
sokezer egyedi kópia van, amelyek mindegyikén több tucat különböző
enzimmel végezhető hasítás: ennek következtében a genetikai
polimorfizmus vizsgálatához szinte kiapadhatatlan anyaggal rendelkezünk.
A hagyományos fehérje polimorfizmussal szemben az scnDNS RFLP
további előnye, hogy a restrikciós enzimek a néma mutációk jelenlétét
is kimutatják. Az scnDNS RFLP-t kiterjedten alkalmazzák géntérképezésben,
azonban populációgenetikai vizsgálatokban egyelőre nem terjedt
el költségessége miatt.
RFLP: riboszomális RNS gének és egyéb közepesen ismétlődő géncsaládok
Az eukarióta nukleuszban a riboszomális gének sok kópiában,
egymás mellett elhelyezkedve vannak jelen. A tandem ismétlődésekben
egy nagyjából 6 kb hosszúságú szakasz szekvenciája szinte teljesen
azonos, az azonos kópiák között azonban rövidebb, változatosabb
szekvenciák találhatók. Az rDNS kópiák száma az emlős és rovar
genom néhány száz ismétlődésétől a növények sokezres másolatáig
változhat.
Az rDNS-t restrikciós enzimekkel kisebb szakaszokra lehet hasítani,
amelyek között a tandem ismétlődések miatt sok teljesen azonos
szekvencia lesz. Az azonos szekvenciák Southern blotting technikával
mutathatók ki, mert azonos szakaszokhoz azonos DNS próba kötődik.
A fragmentumok hosszában mutatkozó egyek közötti eltérések elsősorban
a nem kódoló szekvenciák változatosságából adódnak, de ehhez
hozzáadódik a kódoló szakaszok polimorfizmusa is.
Riboszomális RNS próbákból ma már nagyon sok áll rendelkezésünkre,
azért e vizsgálatok sok DNS szakaszra kiterjeszthetők. Mivel
az egyes szakaszok ismétlődnek a genomban, egyetlen próbával
egyszerre több lokusz vizsgálható. A vizsgálatok szerint a rövid,
nem kódoló szakaszok nagyon változatosak az azonos populációhoz
tartozó egyedek között is.
Az rRNS polimorfizmus hasznos információkat szolgáltattak
a populációk genetikai struktúrájáról, azonban több tényező
nehezíti az rRNS polimorfizmus kiértékelését. Csak megemlítjük,
hogy az rRNS egy egyeden belül is mutathat változatosságot,
ugyanakkor az egyes változatok evolúciója nem egymástól függetlenül
történik.
Miniszatellita szekvenciák és a DNS ujjlenyomat (DNA fingerprintig)
Az elnevezést az indokolja, hogy próbaként nagy polimorfizmust
mutató, rövid, ismétlődő, nem kódoló szakaszokból álló DNS-t
használnak (variable number tandem repeat, VNTR), amelyben
a heterozigócia foka megközelíti a 100%-ot, és így szinte egyedre
jellemző mintázatot, un. DNS "ujjlenyomatot" ad. Ezek az ismétlődő
szakaszok a DNS meghatározott helyén lokalizálhatók.
A DNS ujjlenyomat elemzést kezdetben miniszatellita DNS-en,
azaz 10-60 bp hosszúságú, sokezerszer ismétlődő szakaszokon
végezték. A szakaszok megfelelő jelzett DNS próbával, Southern
blotting módszerrel azonosíthatók. (A többlokuszos vizsgálatokban
a DNS próba hibridizációját olyan körülmények között végzik,
amelyek között némi eltérés a próba DNS és a cél DNS szekvenciája
között nem hiúsítja meg a hibridizációt. Ennek köszönhetően
ugyanaz a próba nem csak több lokusz, de különböző fajok vizsgálatában
is felhasználható.) Amennyiben a restrikciós enzim az ismétlődő
szakaszon kívül hasít, a szakaszok hosszának megfelelő nagyságú
DNS fragmentumok nyerhetők.
Az ábrán 4 kromoszóma szakaszt ábrázoltunk, amelyek lehetnek
azonos, vagy különböző kromoszómák részei is. Az egymás alatti
szakaszok a homológ kromoszómához tartoznak. A ? -gal jelölt
rész az a szekvencia, amely konzervatív módon ismétlődik különböző
mértékben a kromoszómán, ezekhez kötődik a Southern hibridizáció
során a DNS próba. A ?jelöli azokat a helyeket, ahol a restrikciós
enzim hasít.
1. 2.
----? ---???????? --? ----- -? --?????????? -? -
-------? ---?????? --? -------- --? --??? ------? -----------
3. 4.
-? -????????????? ---? -- -----? --------????? ---? ----
? -???????????????? -? --- -----------------? ----?? --? -----
|
